Действие игры одновременно разворачивается в настоящем и в прошлом, во время Третьего Крестового похода (1191 год). В настоящем, героем является Дезмонд Майлс, обычный бармен, который был похищен корпорацией «Абстерго Индастриз» для получения важной информации. Очнувшись, герой обнаруживает себя лежащим в странном устройстве в лаборатории.
В курс дела его вводят двое ученых — Люси Стиллман и Уоррен Видик. Дело в том, что он является последним из древнего рода ассассинов. В частности, одним из его предков был сирийский ассассин по имени Альтаир ибн Ла-Ахад, который и является героем действия в прошлом. Люси и Видик с помощью аппарата «Анимус» декодируют генетическую память Дезмонда, которая, по словам Уоррена, содержит воспоминания о действиях его предков. Молодому бармену приходится раз за разом переживать приключения своего дальнего родственника.

Альтаир — убийца, один из лучших во всем Братстве Ассассинов. Поэтому ему поручено вместе с двумя напарниками найти гробницу в Храме Соломона и добыть из нее некий важный артефакт. В этой гробнице Альтаир встречается лицом к лицу с Крестоносцами, которые также разыскивают артефакт. Он решает, что это отличный шанс уничтожить Робера де Сабле, гроссмейстера тамплиеров. Проявив самонадеянность, ассассин проваливает задание и подставляет под удар своих напарников.

Ему приходится вернуться в Масиаф ни с чем, сообщив главе ордена Аль-Муалиму о своей неудаче. Но случилось так, что один из напарников Альтаира - Малик выжил, потеряв руку и брата, и вернулся в замок. Более того, он принес с собой искомую реликвию — «Частицу Эдема». Во время их разговора на Масиаф нападает Орден Тамплиеров, и хотя Альтаир помогал ассассинам отбиться, его обвинили во всех жертвах этого нападения и нарушении трех основных принципов братства, главный из которых — не подставлять под угрозу товарищей. Аль-Муалим разыграл казнь Альтаира.

Придя в себя, наш герой узнает, что он вовсе не мертв. Однако он был понижен в ранге и уровень доверия к нему упал. Чтобы восстановить свою репутацию в глазах Братства и обрести «мир в себе», Альтаир должен убить девятерых важных людей в трех городах: Дамаске, Акре и Иерусалиме.

Убивая одну цель за другой, Альтаир постепенно выясняет, что его жертвы связаны между собой. Каждый из девяти человек перед смертью раскрывал часть плана тамплиеров. Убив последнюю жертву, наш герой отправляется в Масиаф. Там он понимает, что Аль-Муалим предал Орден Ассассинов и использовал частицу Эдема для подчинения жителей. В тяжелом бою Альтаир убивает предателя и хочет уничтожить артефакт, но потом решает оставить его себе, надеясь найти ему применение во благо.

Игра относится к разряду Freeplay-проектов, то есть игроку дозволяется исследовать мир в свободном порядке. Все игровое пространство представляет собой упрощенную модель Святой земли и поделено на 7 основных частей. Это три крупных города (Дамаск, Акра и Иерусалим), замок ассассинов (Масиаф) и пространство между ними (Королевство), разбитое на две части, а также цитадель Арсуф, локация возле Акры, которая открывается игроку в 6-м блоке памяти.
Королевство представляет собой достаточно обширные площади между гор с небольшими поселениями местных жителей и лагерями крестоносцев. По территории королевства игрок волен передвигаться как пешком, так и на лошади. Почти все солдаты, которых он встречает — враги Альтаира и Братства. Если привлекать к себе внимание, они могут узнать ассассина и попытаться убить.

Масиаф — первое поселение, показываемое в игре. Он построен на горе и каждая следующая его улица располагается выше предыдущей. На самом пике стоит замок Братства, окруженный мощными стенами. В этой деревне игрок может приноровиться к городскому способу передвижения в игре — в стиле паркур, а также узнает основы расследования и выполнит свое первое после понижения в ранге задание — найти предателя среди жителей Масиафа.

Игрок может попасть в город четырьмя способами:

Самый безопасный - пройти в город вместе с монахами. Подойдя к группе из четырех монахов, достаточно нажать клавишу Смешаться с толпой, чтобы Альтаир сам изобразил из себя монаха. Если прислушаться, то можно услышать, как один из послушников молится на латыни. Кроме того, такой способ помогает выполнить ряд других заданий. Монахи отмечаются на радаре специальной иконкой и всегда интуитивно понятно, могут они пригодиться или нет.
Незаметным в город можно пробраться по балкам над городскими воротами. Однако одно неправильно рассчитанное движение - и падение приведёт к необходимости сражаться со стражей.
Также можно войти в город с боем. Этого не стоит делать при входе в незнакомую локацию, иначе от погони уйти будет проблематично.
Можно убить кого-нибудь скрытым клинком возле городских ворот, и, пока стражники осматривают тело, спокойно пройти внутрь.
На любое здание, башню или стену можно залезть. Во всех крупных городах неприступными являются только городские стены, которые не имеют выступов и не позволяют выбраться за границы игрового мира. Архитектура городов в Assassin’s Creed специально спроектирована так, чтобы Альтаир мог вскарабкаться на любую крышу. Но только этим варианты передвижения в игре не ограничиваются. Из строений тут и там торчат балки и деревянные блоки. По ним можно прыгать, на что делался акцент во многих рекламных роликах проекта. Забираясь на здания и перемещаясь по горизонтали, игрок может с лёгкостью уходить от погони, перепрыгивая с брусчатки на ящики, с ящиков — на балки, а с балок — на крышу. На протяжении всей игры эти навыки будут не раз использоваться для выполнения дополнительных заданий.
Очень важной частью игры являются расследования и сопряжённая с ними необходимость слиться с толпой. Каждый раз, попадая в большой город, Альтаир должен как следует осмотреться и найти Бюро ассассинов. Глава Бюро расскажет ему о его будущей жертве и наведет на некоторых людей, которые владеют полезной информацией. Сбор информации сводится к нескольким мини-играм. Так, можно проследить за проповедником, чтобы после с пристрастием его допросить; подслушать разговор на улице; украсть нужный предмет с пояса жертвы; выполнить просьбу информатора. Встречаются задания по разрушению торговых прилавков, на которые по тем или иным причинам укажет информатор. Для выполнения такого задания необходимо толкнуть какого-нибудь человека на прилавок, что всегда провоцирует находящихся рядом стражников на нападение. Наконец, иногда необходимо просто устранить лучников на крышах или представляющих опасность людей, на время собрать некоторое количество флагов и т.д. Все это необходимо проделать незаметно для посторонних глаз, иначе предстоит сражаться со стражей, убегать и прятаться, после чего предпринимать попытку снова.

Разработчики называют Assassin's Creed «социальным стелс-экшеном». В игре очень важную роль играет толпа, которая может стать как преградой, так и подмогой. Игрок может, почти не привлекая внимания, смешиваться с толпами людей, но стоит ему повести себя вызывающе — и волна возмущения прокатится по улице, Альтаира станут искать стражники. После совершения игроком убийства толпа с криками разбегается, хотя, если убить врага незаметно, народ наоборот соберется поглазеть. В бегущем человеческом потоке убийце легче скрыться от погони. При этом надо обязательно использовать элементы управления, чтобы расталкивать бегущих, иначе Альтаир может потерять равновесие и споткнуться.