Игра продолжается вскоре после событий Assassin's Creed, где, в 2012 году, Дезмонду Майлзу —пленнику «Абстерго Индастриз», которого используют для дешифрования его генетической памяти о его предке ассассине Альтаире в машине «Анимус», — грозит смертельная опасность. «Абстерго Индастриз», общественное "лицо" Ордена Тамплиеров, использовали Дезмонда, чтобы определить местонахождение мощного артефакта, именуемого «Частицей Эдема», или «Яблоком Эдема». Используя Орлиное Зрение, полученное в результате «эффекта просачивания» (из-за частого нахождения в Анимусе), Дезмонд видит сообщения и символы, написанные кровью на стене его спальни и в лаборатории предыдущим испытуемым, именуемым Объект 16. Люси Стиллман, сотрудник Абстерго и член Братства Ассассинов, освобождает Дезмонда и прячет его в секретном укрытии с двумя другими ассассинами, Шоном Гастингсом и Ребеккой Крэйн, создавшими улучшенную версию Анимуса. Они предлагают Дезмонду использовать генетическую память о его предке, Эцио Аудиторе да Фиренце, с двумя целями: тренировать Дезмонда в искусстве ассассина с помощью "Эффекта просачивания" и найти другие Частицы Эдема.
Действие игры разворачивается в Италии, в Эпоху Возрождения, конец XV века. Главным героем игры становится семнадцатилетний юноша по имени Эцио (потомок Альтаира). Отца Эцио, Джованни Аудиторе, предал его лучший друг, и в ходе обвинения, отец и братья Эцио были повешены. Для Эцио это была душевная травма, потерять семью. Он убивает предателя его отца и пытается укрыться вместе с матерью и сестрой у своего дяди Марио Аудиторе, на вилле Аудиторе в Монтериджони.
Позже Эцио узнает, что его семью предала семья Пацци, и он решает, поквитаться с ней. Сперва он убивает младшего из этой семьи, Вьери Пацци, потом его отца, Франческо Пацци, а затем старшего из семьи предателей— Якопо Пацци — и его помощников.

Действие прерывается и переносится в настоящее время. В ходе интермедии Люси проверяет навыки Дезмонда. Во сне у Дезмонда возникают галлюцинации, и он видит события из жизни Альтаира, главного героя предыдущей части. На следующий день Дезмонд вновь погружается в воспоминания Эцио.

Из собрания тамплиеров, в котором непосредственно участвовал Якопо, Эцио узнал, что его приключение заводит его в Венецию, где он и гильдия воров убивают одного из заговорщиков — Эмилио Барбариго, а также Карло Гримальди, который отравил венецианского дожа Джованни Мочениго. Затем Эцио убивает Марко Барбариго, занявшего место прежнего дожа, позднее Эцио убил Сильвио Барбариго и телохранителя Марко Данте Моро. Но он упустил корабль, на котором те собирались уехать. Через два года он узнаёт, что скоро возвращается корабль тамплиеров с острова Кипр, и на нём, вероятно, будет одна из частиц Эдема. Следуя за курьером, Эцио лицом к лицу сталкивается с Родриго Борджиа, который убеждён, что он некий пророк. Борджиа удаётся скрыться, но Эцио узнаёт, что люди, помогавшие ему на всём пути — ассассины. После нахождения частицы Эдема— Яблока Эдема — Эцио отправляется в Романью, где помогает Никколо Макиавелли и Катерине Сфорца защитить их город — Форли. Но таинственное Яблоко было украдено, и поиски его приводят нашего героя обратно во Флоренцию. Воспользовавшись Яблоком, Джироламо Саваноролла захватывает власть во Флоренции, но Эцио убивает девять сторонников Савонаролы по всему городу, подрывая его планы. Разгневанный народ собирается заживо сжечь «просветителя», но Эцио убивает его раньше.

Пройдя посвящение, он направляется в Рим, где ему предстоит раз и навсегда разобраться с Борджиа, который стал Папой Римским. Одолев противника, Эцио узнаёт, зачем Родриго стал Папой Римским и зачем он охотился за частицами Эдема. Весь секрет в том, что под Римом покоится «бог», попасть в гробницу которого может только пророк, используя яблоко и посох. Пророком оказывается сам Эцио, не знающий о пророчестве, но просто следуя своей судьбе, он исполняет его. В гробнице Эцио узнаёт от некой Минервы, что люди были созданы Первой Цивилизацией, которую древние люди принимали за богов, но они давно погибли от загадочной катастрофы, та же участь ждёт Землю, и Дезмонд единственный, кто может помешать этому. Тем временем в наши дни в логово ассассинов вторгаются люди Абстерго, и Дезмонду, Люси, Шону и Ребекке приходится бежать.

После выхода оригинального Assassin's Creed, к разработчикам поступало много информации от критиков и, что самое важное, от сообщества фанатов. Команда хотела знать, что в игре понравилось, а что нет, чтобы в будущем не допустить тех же ошибок и сохранить всю привлекательность. Первая часть стала одной из самых быстропродаваемых игр в истории. И не последнюю роль в этом сыграл интуитивно простой и понятный геймплей. Но был и существенный недостаток – однообразность. Почти вся игра состояла из того, что нужно было взять задание в бюро, собрать информацию, устранить цель и вернуться в бюро. Для многих это было поводом для разочарования. Сиквел обещает исправить этот недостаток. «Мы думаем, что нужно отказаться от ранней идеи построения миссий», - говорит Патрис, - «Она явно не подходит».
Assassin's Creed 2 не страдает однообразностью. Вы можете путешествовать по разнообразным территориям и получать интересные задания. Их намечается 16 уникальных видов. Некоторые из них заставят вас побывать в тех местах, где вы проводили сюжетные миссии. Так, например, в одном из таких заданий Эцио попадает в дворец, где одна из дворянок хранит какую-то тайну. Она рассказывает герою, что находится в большой опасности, и он должен защитить ее, пока она будет следовать улицами к докам, а потом сопровождать, пока они не будут в безопасности.
Пассивные задания с подслушиванием и воровством исчезли, уступив место более активным. Такие как слежка за человеком в толпе или преследование. «Когда вы добавляете что-то новое в миссии, она ощущается совершенно по-другому,» - говорит Патрис, - «Вспомните, сколько всего вы могли делать в GTA и каждый раз игра ощущалось по-разному. Мы решили применить этот опыт, чтобы немного разнообразить миссии». В общем планируется порядка 200 миссий. Каждая будет требовать от вас каких-то особых навыков, каждая будет уникальна и запомнится чем-то своим.
Структура миссий включает в себя сочетание как масштабных, не похожих друг на друга событий, так и мелких элементов, которые, тем не менее, будут проработаны так же детально. Прыгая с крыши, нельзя быть всегда уверенным, что внизу будет удачно расположена кипа сена. Укрытием может послужить не только сено, а любая телега с товарами или даже с уловом рыбака. Во время подготовки к крупной миссии, где будет много стражников, осторожные игроки могут очистить окрестные крыши и улицы от большинства, что существенно облегчит им работу позже. Расширенный арсенал атак Эцио поможет ему справляться с поумневшими врагами, которые используют против героя свои уникальные методы боя и преследования (то есть тамплиеры в тяжелых доспехах теперь не будут резво скакать по крышам, как в первой части). Система восстановления здоровья будет также усовершенствована для создания более динамичной и реалистичной обстановки. «Синхронизация» теперь будет влиять на скорость восстановления здоровья, но гораздо проще будет обратиться к одному из докторов, которых можно найти прямо на улицах.
Любой найденный секрет совершенствует какой-то параметр. По миру будет рассыпано очень много секретов и скрытых мест. «Будут не только флаги, а еще статуи, монеты много чего еще», - говорит креативный директор, - «И за нахождение каждого вы будете получать существенную награду».